ביוטכנולוגיה/פתרונות טכנולוגיים לשימוש באנזימים
הקושי בייצור אנזימים נובע מכמה סיבות
- התהליך ארוך מאוד ובסופו מתקבלות כמויות מוגבלות של תוצר.
- תהליך הפרדת האנזימים מחומרים אחרים יקר מאוד,ארוך מאוד ומסורבל מאוד.
- במקרים רבים יש קושי בהפרדת התוצר מתערובת התסיסה.
הצעות לפתרונות
הפעלת האנזימים מתוך התא השלם
יתרונות:
- אין צורך בהפרדה.
- חוסך שלבים ועל כן מהיר יותר.
- האנזים יציב ופעיל משום שנמצא בסביבתו הטבעית.
- מאפשר עבודה עם מערכת רב אנזימטיות.
חסרונות:
- התוצר עלול להיות סובסטרט לאנזימים אחרים בתא.
- חומרי לוואי רבים מאוד - מערך אנזימטית מגוון מאוד בתא.
- קושי רב בהפרדת התוצר המבוקש (אם התוצר הוא תוך תאי).
- קשה לבקר את מידת הפעילות האנזימטית.
הפעלה מתוך התא השלם בתנאים קיצוניים
- אם האנזים יציב מאוד - אפשר לעבוד בטמפ' גבוהה שתפגע בחלק גדול מהאנזימים האחרים אך תשאיר את האנזים המבוקש.
- עבודה בערכי pH קיצוניים - אם זה מתאים לפעילות האנזים. פעילות זו נעשית בליזוזום שם יש ערכי pH קיצונים ולכן חשוב לזכור כי פתרון זה מתאים לפטריות ולשמרים שהם אאוקריוטי (לחיידקיים אין ליזוזום).
- שימוש בחומרים כימים הפועלים כמצלבים - כנסתם לתוך התא מובילה לצלוב בין מולק' חלבון שונות ובעקבות כך החלבונים המצולבים מפסיקים להיות פעילים.
יתרונות:
- אין צורך בשבירת התא בתהליכי הפרדה.
- הפעילות ספציפית יותר מאשר בפתרון 1 (הפעולה מתוך התא השלם).
חסרונות:
- עלולה להתרחש פגיעה באנזים עצמו.
- קשה לבקר את מידת הפעילות האנזימטית.
- מפתרונות 1-2 עדיין לא פתרנו את הקושי שבהפרדת התוצר.
אנזימים מקובעים
אנזימים מקובעים - קישור האנזים לחומר בלתי מסיס.
יתרונות בשימוש באנזימים מקובעים :
- שימוש חוזר - מאפשר הקטנה משמעותית בהוצאת הייצור. האנזים מפיק ומנוקה פעם אחת וניתן להשתמש בו מס' רב של פעמים.
- הפרדה קלה של התוצר - האנזימים המקובעים שוקעים (בשל גודלו של המקבע) והתוצר מופרד ומסיס, חסכון אדיר בעלויות ההפרדה והניקיון של התוצר.
לא תמיד יעיל לקבע אנזימים, כמו למשל בתעשית המזון הכביסה ועוד, וזאת כיוון שהאנזימים המקובעים לא ימוחזרו (האנזימים ישאר בתוצר, באוכל ובאבקת הכביסה) ולכן, כל תהליך הקיבוע יהיה חסר טעם כלכלית.
שיטות קיבוע
ספיחה או קישור יוני לנשא
ערבוב המקבע עם האנזים, ייצור המצב בו מולקולה אנזים ייספחו למקבע בעקבות כוחות משיכה חשמליים.
יתרונות: זול מאוד ומהיר מאוד.
חסרונות: ישנם תנאים בהם הקשר יתפרק, למשל, שינוי pH או שינוי ריכוז מלח יובילו לניתוק האנזים המקובע.
כליאה
האנזים מעורבב עם החומר המקבע כך שהוא נכלא בתוכו, המקבע אינו אטום והוא מאפשר מעבר של חומרים דרכו. הפתחים בחומר המקבע:
- צריכים להיות גדולים מספיק על מנת לאפשר מעבר של סובסטרט ושל התוצר.
- צריכים להיות קטנים מגודל האנזים על מנת שהאנזים לא יזלוג החוצה.
יתרונות:
- זול ופשוט
- יש פחות חשש לאיבוד האנזים מאשר בשיטת הספיחה שגודל החורים מתאים והאנזים אינו בורח.
חסרונות:
- הסובסטרט מגיע לאנזים בדיפוזיה - ישנו פרק זמן בו לא מתבצעת פעילות אנזימטית (זה משהו שצריך להילקח בחשבון בתהליך הייצור).
קישור כימי
המקבע עובר טיפול כימי ובו קושרים זרועות מולק' למקבע. זרועות אלה יקשרו את האנזים,כל הקשרים קוולנטים.
יתרונות: הקשרים החזקים מבטיחים שהאנזים לא יתנתק מהמקבע.
חסרונות:
- הקשר בין הזרוע למולק' עלול להתרחש דווקא באתר הפעיל ואז לא תהיה פעילות אנזימטית.
- יקר מאוד ומסובך לביצוע.
התהליך התעשייתי לשימוש האנזים המקובעים
-
ראקטור מנתי (=בוחש) מעורבל (Batch Reactor) - בתוך תמיסת סובסטרט מוסיפים את האנזימים המקובעים תוך ערבול עדין. בסוף התהליך, כאשר הסובסטרט עבר לתוצר, מופסק הערבול והמקובעים שוקעים. את התוצר מוציאים, מפיקים ומנקים אותו מהפרמנטור. הפרמנטור עובר סיבוב ייצור נוסף עם האנזימים המקובעים. -
ראקטור מצע ארוז (packed bed reactor) – המקובעים ארוזים בצפיפות בתוך הפרמנור ארוך וצר. הסובסטרט מוזרם בקצב קבוע מתחתית הפרמנטור והתוצר נאסף מהקצה העליון. יש כמות גדולה של תוצר. -
ראקטור מצע מרחף – האנזימים המקובעים מרחפים בתוך הפרמנטור בשל זרימת הסובסטרט מכוון למטה למעלה. זרימת הסובסטרט נקבעת על קצב המאפשר ריחוף של גרגרי המקבע והפיכה יעילה של הסובסטרט לתוצר. התהליך הוא תהליך רציף.
יתרונות וחסרונות של שלושת הפרמנטורים
- בקרה על pH (חומצה/בסיס) יכול להתבצע רק בפרמנטור מנתי.
- כשתוצר הפעילות האנזימטית מאוד צמיגי - לא ניתן להשתמש בפרמנטור הארוז כיוון שהוא ייסתם (עדיפות למנתי או למרחף).
- בכל מצב אחר - העדיפות תהיה לפרמנטור ארוז כי בו מיוצר כמות הגדולה ביותר של תוצר בזמן הקצר ביותר.
תאים מקובעים
השיטה לקיבוע אנזימים הובילה לרעיון לקבע תאים שלמים במקרים בהם תהליך הייצור מופעל מתוך התא השלם.
בקיבוע תאים - השיטה המועדפת היא כליאה כיוון שהחומר המתאים לקיבוע תאים הוא אלגינט.
אלגינט – רב סוכר עשיר בקבוצות קרבוקסוליות שהופך לג'ל מקבע במגע עם יוני Ca2+. יונים אלה יוצרים את הכיסים ברשת. הקשר בין Ca2+ לקבוצה הקרבוקסילית חזקים ומאפשרים את המסתו במים. טפטוף של התאים העתידים להיקבע אל תוך המים ובעקבות כך כליאה מהירה ופשוטה.
המגבלה/בעיות בשימוש באנזימים מקובעים - השפעת הקיבוע על הפעילות
המגבלה העיקרית של הקיבוע היא שכבת נרנסט (שכבת מים ספוחים). השכבה עוטפת את הנשא והאנזימים, ואינה בתנועה, ועל כן התנועה הדיפוזית דרכה איטית מאוד. כתוצאה מכך, כמות הסובסטרט הנחשפת לאנזים קטנה משמעותית מכמות הסובסטרט האמתית שהוספה לפרמנטור.
שני פתרונות:
- הוספת כמות גדולה יותר של סובסטרט להגדלת הדיפוזיה באיזור שכבת נרסנט.
- ערבול עדין מקטין את עובי השכבה.
קיבוע בשיטת כליאה יוצר מצב חמור יותר
בנוסף למעבר האיטי של הסובסטרט דרך שכבת נרסנט, ישנה מגבלה במעבר באיזור Cשהוא פנים הנשא, שם הדיפוזיה איטית אף יותר.
במעבר הסובסטרט בתוך הנשא, ישנה תלות בכמות ובצפיפות האנזימים בתוך הנשא –ככל שריכוז האנזימים בתוך הנשא גבוהה יותר, ישנו פחות סיכוי שהאנזימים הממוקמים בפני הנשא "יראו" את הסובסטרט. היתרון של מצב כזה הוא שהאנזימים שנמצאים באזורים פנימיים ופעילים פחות משמשים "גיבוי" לאנזימים הנמצאים במעטפת.
דוגמאות לשימוש באנזימים מקובעים
אמינואדילאז – קישור בסיפוח
- חוץ תאי (שינוי חומצה אמינית מ-D ל-L).
- ראקטור מצע ארוז.
- חסכון של עד 40% לעומת שימוש באנזים מסיס.
פניצילינאז (אדילאז) – קישור כימי
האנזימים הוא תוצר תוך תאי השובר את הקשר א' ומפריד בין שני חלקי מולקולות הפנצילין. באנזימים משתמשים בתעשיית התרופות לייצור אנטיביוטיקה סמי (חצי) סינתטיות (=טבעיות).
ראקטור מנתי מעורבל בשל הצורך לאזן PH תוך כדי הפעילות (תוצרי הביקוע האנזימטי חומצים).
גלוקוז איזומראז – מצע ארוז
מבצע איזומריזציה (משנה מרחבי של חומר למבנה שניוני שלו) של גלוקוז לפרוקטוז. משמש בתעשיית המזון, בעיקר לממתקים – מגלוקוז מתקבלת תערובת של גלוקוז ופרוקטוז.
האנזים תוך תאי מופעל מהתא השלם לאחר שעבר טיפול בגלוטראלדהיד (= טמפרטורה גבוה)- התא מת והאנזים פעיל.
האנזים פעיל ב-60 מעלות צלזיוס, לכך יתרון – הקטנת סיכון לזיהום והגדלת קצב הגידול.
שימוש באנזימים לאנליזות (=אבחונים)
תחומים לשימוש :
- תעשיית המזון - מעקב אחר ריכוזים של חומרים שונים.
- רפואה - בדיקות של נוזלי גוף שונים.
- תעשיה - ביקורת ומעכב אחר התהליך.
דוגמאות ליישומים
קביעת ריכוז גלוקוז
ריכוז הגלוקוז נקבע מתוך מידת הצביעה של החומר (=D). שימוש באנזים גלוקוז אוקידאז המקובע יאפשר ביצוע הבדיקות מספר רב של פעמים בכמה דגימות. דוגמא : שימוש בספקטופוטומטר לקביעת נוכחות (ריכוז) גלוקוז.
ביוסנסור (חיישן ביולוגי) - אלקטרודת Ph
אלקטרודת Ph = פעילות האנזים אצטיל כולין אסטראז. בעקבות הפירוק ACH (חומר המחבר בין עצם לשריר) נורצת חומצה. הפעילות האנזימטית מובילה לירדה בערך ה-Ph.
ביוסנסור (חיישן ביולוגי) אלקטרודת חמצן
גלוקוז + חמצן ---> גלוקונולטון +
קביעת ריכוז גלוקוז נקבעת על פי ירדה בריכוז החמצן.
ביוסנסור - חומר המעביר אלקטרונים
תבנית:להשלים מתווך מעביר אלקטרונהים.
ביוסנסור - מיקרולורימטר
תבנית:להשלים שינוי טמפרטורות בעקבות פעילות אנזימטית. אינו מוגבל לסוג ספציפי של אנזימים.
הערות
- אנזים, מטבוליזם ועוד - הם אינם יצור חיי ולכן אסור לתת האנשה לאנזימים, כלומר, מייצרים מתים וכד'
- כל דוגמאות ליישומים דוגמאות לגלוקוז אוקסחדאז.